Stuart Firth-Clark†
†Cresset, New Cambridge House, Bassingbourn Road, Litlington, Cambridgeshire, SG8 0SS, UK
设计、执行一个成功虚拟筛选的关键是利用所有关于靶标的可用信息，在选择、采购化合物时尽可能多地探索不同的化学空间。在本研究中，我们联合使用了基于配体的虚拟筛选方法Blaze与以及从Flare得到的关于蛋白结构的信息以寻找可能合适作为FOXO-肽模拟物的配体。
前言
在药物开发项目中针对生物分子结构采用的方法取决于与其结合的对象是什么（图1）。靶向已知调节剂结合位点最常见的方法是引入竞争结合同一位点的配体。然而，许多生物大分子并没有明显的小分子调节剂，但它会与其它诸如核酸（DNA和RNA）或蛋白之类的生物大分子相互作用。在后一种情况下，蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）通常发生于两种相互作用蛋白的表面区域。两个分子之间的相互作用能是从较大表面积上的许多不同的较小接触中获得的，而不是集中在一个较小的区域（例如结合位点）中。 这使得用小分子靶向这些相互作用变得困难，因为通常没有足够的相互作用可供小分子发生强烈结合以与比其大的蛋白进行竞争结合。
图1. 蛋白靶标X可能的结合对象
尽管如此，在某些情况下，PPI界面上的一小部分承担了两个结合伙伴之间的大部分结合能。在实验研究中，可用小肽探针来模拟蛋白结合对象的一小部分以确定各个区域对结合的重要性。 这样就可能识别出哪一个较小的区域为结合提供了重要的贡献，然后就有可能用一个小分子靶向该区域。
当靶标区域确定后，下一步就是开始寻找能够“模拟”原始肽的可能小分子。一种方法是虚拟筛选，它获取结合区域的已知信息，并寻找能够与感兴趣区域进行有利相互作用的分子。利用Cresset的虚拟筛选平台Blaze，可用肽段的静电、疏水以及范德华等特征来搜索商业化合物数据库以发现具有类似特征的化合物。
寻找Forkhead box proteins (FOXO)小分子先导化合物
FOXOs是一种具有N-末端DNA结合域的转录因子。它们识别许多不同的蛋白伴侣，例如14-3-3蛋白质。干扰FOXO1通路可致多种代谢疾病，包括糖尿病；而FOXO3与不同的肿瘤实体相关，促进肿瘤血管生成，并参与细胞凋亡。因此，FOXO蛋白家族似乎是药物发现项目的好靶标。然而，与它们发生关键相互作用的是其他生物分子（如DNA），因此这是一个研究起来复杂的体系。
该项目的第一阶段是整理与FOXO蛋白相关的可用数据。没有发现已知的小分子，但FOXOs是转录因子蛋白，因此与DNA结合。通过UniProt搜索找到合适的蛋白序列后，识别出了FOXO蛋白家族已有的PDB结构。
靶向DNA结合域
有了FOXO蛋白与DNA相互作用的结构，就可以在Cresset药物发现平台Flare中，对FOXO蛋白家族DNA结合域的现有晶体结构进行比对与叠合（图2a）。在完成叠合后，很明显，小的、配体大小的分子与FOXO结合时很少有专一的相互作用；此外，所有可能结合位点的尺寸都非常小（图2b）。因此，需要考虑其它的替代方法
图2. a.在Flare里，你可以下载晶体结构、进行序列比对、然后对将蛋白叠合。b. 相对小的空腔跑个虚拟筛选研究并不理想
靶向14-3-3蛋白识别位点
FOXO蛋白也是14-3-3蛋白的结合对象，14-3-3蛋白的识别位点在FOXO蛋白的N末端区域附近。14-3-3蛋白大部分时候是二聚体蛋白，其作用是识别磷酸肽，并负责抑制FOXO。在PDB结构6QZR中，FOXO的磷酸肽片段与14-3-3蛋白结合（图3），基于该结构有可能设计出一种虚拟筛选策略。
图3.14-3-3蛋白（浅棕色）与FOXO1磷酸肽片段（粉红色）的晶体结构（PDB 6QZR）
本研究的目的之一是使用Blaze来靶向14-3-3蛋白的FOXO-结合位点，利用晶体结构中FOXO肽的结构特征来实现。以FOXO肽的中心四个残基为例，可以识别出该部分的关键特征（图4），即正电荷区域（红色球体）、负电荷区域（蓝色球体）、疏水特征（橙色球体）和基于形状的特征（黄色球体）。
图4. 描述FOXO肽分子特征的场点(Field point)
Blaze界面（可通过基于web的门户网站或通过Flare访问）还允许用户通过引入药效团或场点约束来指导配体搜索。当已知的特定相互作用或特征存在于已识别的配体中时，药效团或场点的约束功能就非常有用。在用Blaze进行虚拟筛选时，可以通过各种属性（如特定供应商或分子量）来限制需要搜索的商用化合物数据库。在Cresset Blaze数据库中，目前有大约2000万个分子可以用于搜索（图5）。
图5. 在Flare界面上可以建立Blaze输入参数。比如，引导虚拟筛选使用场和/或药效团约束，定义搜索的供应商数据库与分子大小
将打分最高的命中化合物被下载到Flare，并在14-3-3受体里可视化观察结果。尽管没有使用14-3-3蛋白来指导虚拟筛选，但是检索式(query)是从6QZR晶体结构获得的，因此虚拟筛选命中的化合物也位于14-3-3蛋白同样的参考框架中。
一旦得分最高的命中化合物被下载到Flare中，就可以进行进一步的后处理和分析（图6），例如，目视检查以去掉看起来内能过高的配体；将化合物对接到14-3-3蛋白；以及研究新配体与结合位点的静电互补程度。在Flare中，还可以识别物理性质（如TPSA、logP或柔性）理想的分子，从而确保仅选择具有适当计算性质的分子。从虚拟筛选实验的结果里购买化合物时，确保化学空间被充分采样是很重要的。 在即将发布的Flare V5中，也可以对结果聚类，以帮助选择化合物。
Figure 6. Flare的图形技术可以用来指导虚拟筛选后处理，从Blaze虚拟筛选命中化合物中挑选化合物。a. 分子对接 b. 静电互补性分析 c. 聚类
图7是几个Blaze输出结果的示例。最左上角的分子（1）是检索式肽，大部分示例通过羧酸基团与磷酸识别位点相互作用，但有些分子(比如6,9)与该位点不发生相互作用，这对本研究有令人感兴趣的帮助。
图7. Flare用来展示Blaze虚拟筛选结果
结论
在设计虚拟筛选策略的时候，可以组合使用基于配体和基于结构的方法以利用所有可用的靶标信息。设计良好的搜索策略有能力识别到那些与其他生物大分子（如核酸和RNA）或蛋白相互作用的、更具挑战性的靶标的小分子苗头化合物。
关于BLAZE
Blaze提供以云计算的方式提供虚拟筛选服务，BLAZE虚拟筛选包含了一个有供应商提供销售的~2000万个分子的化合物库，在线完成不需要自己准备软、硬件资源。